(90)台北市立中山女子高級中學科學暨藝文展覽會

作品說明書

組別(年級):三年級

 

 

科別:化學科

 

 

作品名稱:大自然的調色盤──樹葉的色層分析

 

 

 

編號:

(由科學館統一填列)

 

 

 

 

 

 

 

 

名稱:大自然的調色盤──樹葉的色層分析

內文:

一、              研究動機:

(一)、     漫步在校園中,看到綠意盎然的榕樹中,摻雜著許多深淺不一的葉片,興起了我們想一虧究竟的念頭。

(二)、     在街道我們可以看到兩旁的樹木,有絕大部分的面積接觸到空氣,會沉積許多的灰塵在樹葉上,而每個地區及街道的灰塵量又不同,因此我們想利用色層分析,了解污染對於色素究竟有無影響。

 

二、              研究目的:

(一)、 從手邊現有試藥中,選出能在TLC色層分析法達到最佳分離效果的展層液。

(二)、 比較同一棵樹上,老葉、嫩葉及枯葉所含色素之差異。

(三)、 研究空氣中微塵的多寡對於植物色素的影響。

 

三、              實驗原理:

色層分析法(Chromatography)是俄國植物學家Mikhail Tswett在1903年研究葉綠素化學時發現的,他利用溶液將色素流經一個填滿細粉狀碳酸鈣的白堊柱,將綠色葉子中的色素分離,這篇論文在1906年才發表。由於葉綠素可以在吸附劑上形成許多色素,所以把它就做「色層分析法」。〈希臘字Chroma意思為顏色,而graphein為白色。〉

層析法均是使用固定項及流動相,混合物中的成分藉由流動相的攜帶流經固定相,因樣品中成分有不同的遷移速率而將之分離。層析法有兩種型態,一為管柱層析法,固定相在細的管柱,流動相利用壓力或重力流經固定相。另一種為平板層析法,流動相利用毛細現象或重力作用流經固定相。

 

(一)、     TLC〈薄層色層分析

1、           TLC  ── 即薄層色層分析。將待分離的混合物,溶於適當溶劑中,在TLC板〈我們採用矽膠板〉之一端近處點滴,至於展層液中,則可將原混合物分離出一連串的小色點,每一小點相當於一種化合物。

2、           Rf──所謂Rf值,就是指把原本點滴位置至色點之距離,除以點滴位置至展層液在TLC板所行的最前端的距離。

 

 

(二)、     LSC〈液/固相色層分析

/固相色層分析是一種吸附作用的色層分析法,吸附體如矽膠、礬土等堆積在一條管柱內,樣品混合物再由流動的液體推動,經過吸附體而告分離。如同TLC有Rf值,LSC也可以計算K值,但是我們的實驗目前在定性,尚未計算。

1、           薄層色層分析(TLC)也是液/固相色層分析的一種,由TLC數據也可推測LSC管柱的結果。高性能LSC有TLC的優點,也同時具有較佳的定量、易置備分離、樣品回收方便、高效率等優點。

2、           TLC所用的溶劑和吸附劑的組合,可以用到管柱分析上面,結果反而更快,解析力更強,回收率更高,因此我們所採用的溶劑和吸附劑皆與前面的實驗相同。

3、           兩者最大的差異在於:TLC是藉蒸汽平衡的吸附,流動相(展層液)利用毛細作用上升;LSC卻是以沖提的方式,吸附體可預濕,流動相在穩定狀態的條件下流入管柱中。在混合式溶劑的系統中,因為各溶劑對吸附的親和力不同,使Rf值與K值略有不同,但在單一溶劑系統中,兩者是相似的。

(1)、              管柱: 是色層分析的心臟,分析的成功與否,端視管柱的選擇而定。材料最好為玻璃或不繡鋼,我們在此利用玻璃管柱。管柱的長度不拘,但長管子的解析能力更強。

(2)、              吸附體:吸附體使用的粒子越小,質量轉移的速度越快,效率越高。

常用的吸附體多是極性的固體,例如矽石(SiO2)x,礬土(Al2O3)x。樣品沖提的次序由其極性決定,一般而言,具多種官能基的化合物中,最具極性的官能基主宰該分子的吸附特性,而羥基是矽石和礬土表面最具吸附力的官能基。其中矽石較為廣用,因其反應性比礬土低,使管柱效率更佳。矽石表面的羥基會部分離子化而使他帶弱酸性。根據Snyer訂出的一些選擇性如下:

*   較適合礬土:酸性化合物、不飽和分子、鹵素基、對酸敏感的化合物。

*   較適合矽石:中度的強鹼、對鹼敏感的化合物。

(3)、              流動相,是影響分析的參數之一,作為流動相液體應具備的條件:

*    不改變管柱之性質

*    能溶解樣品

*    粘度低,以減少壓力落差,增加質量轉移速率

*    純度高,無雜質

(4)、              溫度:管柱和偵測器的溫度控制對液相色層分析而言是可有可無。

(5)、              若失去解析能力,可能的原因:

*   管柱超載、變質

*   強而有力的物質留在管柱裡

*   管柱失去液相

四、              研究設備器材:

試藥級甲苯、乙醚、乙醇、丙醇、丙酮、丁酮、乙酸乙酯………各一瓶

長條濾紙……………一包

研缽和杵……………各二

毛細管………………若干支

燒杯50mL、250mL…各一

錐形瓶50mL…若干個

長玻棒……………一支

陶土網、加熱設備……………一組

吸量管及安全吸球…………各一

可密閉的玻璃瓶(內徑大於10cm)………兩個

矽膠板(TLC)……………規格:20×20cm;25 sheets

滴定管夾…………一組

層析管、矽膠粉

玻璃絨……………少許

葉綠素靈Chlorophyllin, coppered, trisodium salt……………25g(一罐)

護貝機、護貝膜、吹風機

        

五、              研究過程:

(一)、     試驗實驗:

1、           為了找出最適當的萃取液及展層液,我們先利用學校裡現有的有機溶液進行試驗實驗,以選出能夠達到最佳效果的試藥。

2、           實驗步驟:

(1)、              將樹葉撕碎,分成若干等份,放入研缽中,分別以乙醇、丙酮、甲苯、乙醚、乙酸乙酯、丁酮浸泡,用缽搗碎樹葉色素溶液,至溶液呈翠綠色。

(2)、              用毛細管吸取汁液,滴在長條濾紙一端上,並以吹風機吹乾。

(3)、              取四個可密閉之玻璃瓶,分別放入上述四種不同的有機溶劑,再放入滴有萃取液之濾紙,將其底部進入溶劑中。

(4)、              觀察色素展開的變化,選出效果最好的一組作為展層液及萃取液。

(二)、     正式實驗

1、            

(1)、              在試驗實驗之後,我們決定:

*    萃取液:以丙酮為佳

*    展層液:若色素中大部分為綠色者,則使用甲苯加丙酮(1:1)

                若為紅色者,則用丙醇;若為黃色者,則使用乙醚

操縱變因:老葉、嫩葉與枯葉間的比較。

(2)、              實驗步驟:

¨      將樹葉洗淨擦乾後5g撕碎,放入研缽中,倒入丙酮15mL研磨,至樹葉之色素溶出

¨      將矽膠板裁為10×10cm之大小,利用毛細管吸取萃取液,點在矽膠板的一角(如圖所示,需預留適當空間,以免色素被展層液蓋過),並立即以吹風機吹乾,以免色素因毛細作用擴散開。於同一點處共滴15滴,每滴為毛細管高度1cm的量。

¨      取一個可密閉的容器,內徑需大於10cm,倒入展層液至適當高度(但不可蓋過點滴位置),將點好色素的矽膠板垂直放入容器中。(注意!展層液上升必須呈水平。)

¨      當吸附高度接近頂端時,將矽膠板取出,用吹風機迅速吹乾,再順時針旋轉90°放入另一種展層液中,等待展層結果。

¨      當吸附高度接近頂端時,將矽膠板取出,用吹風機迅速吹乾,將兩次展層液、日期及植物種類、名稱紀錄在板上,用護貝機護貝。

¨      將待測樹葉展層的結果和葉綠素靈展層的結果相比較。

 

2、            

    我們選定了七個地方的榕樹葉以做比較:中山女高校內;長安東路、建國北路口;長安東路二段;中正國小;八德路巷內;南京東路、建國北路口;信義路四段。此七點的交通流量不同,推測空氣污染量也不同,對此展開研究。

操縱變因:不同路段之榕樹葉

(1)、              將樹葉洗淨擦乾後5g撕碎,放入研缽中,倒入丙酮15ml研磨,至溶液呈翠綠色

(2)、              20 cm × 20cm的矽膠版,於右下角同一處點下15滴萃取液,捲為圓筒狀,置入裝有展層液體積比為——乙酸乙酯:丁酮=15:1的玻璃瓶中,展層17cm。

(3)、              取出吹乾後,標下色塊的位置,順時針旋轉90°,改置入展層液體積比為——乙酸乙酯:丁酮=1:15的玻璃瓶中,展層17cm 。

(4)、              取出吹乾後,將兩次展層液、日期及植物種類、名稱記錄在板上,用護貝機護貝。

(5)、              計算Rf值,比較每個地點榕葉的Rf值。

                                                                    

 

 

 

 

3、            

在操作了正式實驗(二)之後,發現第二次展層時的分層並不明顯,推測第一次展層所分離出來的色素已經很純了,不需要做再一次的展層,因此我們改變方法,改用長條型TLC板,寬度2cm,但展層長度仍為17cm。

操縱變因:不同路段之榕樹葉

(6)、              將樹葉洗淨擦乾後5g撕碎,放入研缽中,倒入丙酮15ml研磨,至溶液呈翠綠色

(7)、              20 × 2cm的矽膠版,於下方同一處點下萃取液,放入裝有展層液體積比為——乙酸乙酯:丁酮=15:1的玻璃瓶中,展層17cm。

(8)、              取出吹乾後,標下色塊的位置,將兩次展層液、日期及植物種類、名稱紀錄在板上,用護貝機護貝。

(9)、              計算出Rf值,比較每個地點榕葉的Rf值。

 

4、            

    LSC比TLC應用的更廣,而其回收性也比後者更佳,所以我們在結束TLC實驗後,決定嘗試以相同的色素、吸附劑及流動相,轉向LSC做進一步的分析。

(1)、              將濾紙裁至管徑大小,舖在層析管內部底端。

(2)、              將吸附劑及流動相填入層析管中,至三分之二管長。(為了吸附劑間緊密,使層析效果更佳,因此在填裝時,先倒入少許流動相,再填入吸附劑,並用玻棒輕微攪拌,靜置待其沉澱,如此重複上述之步驟至所需高度。)

(3)、              在頂端舖上濾紙,填入約2-3cm高的玻璃絨,再舖一層濾紙。

(4)、              填入色素,打開管栓,使液體得以由底部流出。待色素約全滲入管中,再倒入流動相。

(5)、              50mL的錐形瓶收集不同區塊的色素,並觀察其間之差異。

 

六、              研究結果:

(一)、             經實驗後展層液與介質之間的比較:

        介質

  展層液

Silica gel

 

丙酮

參考濾紙結果,故不採用

用來展紅色色素,

綠色色素沒有效果

甲苯

黃色色素展的很快

綠色色素展層效果佳

丙酮+甲苯

效果好,分層明顯

分層效果沒有矽膠板好

乙酸乙酯

分層多,色塊明顯

未試驗

丁酮

分層不明顯,但呈帶狀分佈

未試驗

乙酸乙酯:丁酮=1:15

帶狀分佈,且色塊分隔可辨別

未試驗

乙酸乙酯:丁酮=15:1

分層多,色塊分佈

比純乙酸乙酯明顯

未試驗

石油醚

色素可以展開,但效果

不如前述之兩種混合液佳

展層效果不明顯

乙醇

可以展,但是分層不明顯,

不易觀察

效果差,不能展

丙醇

紅色會展,但也是看不出分層

未試驗

乙醚

分層明顯,尤以黃色效果佳

效果差,沒有分層

紅色色素可以展,旦矽膠

吸水速度不均,分層效果不佳

僅紅色色素,但展不遠

 

(二)、     在二次展層的實驗中,色素分層效果並不明顯,因此我們決定將老葉、嫩葉和枯葉的比較視為定性實驗。

(三)、 以下是由不同地點採取樣本測出的Rf值:

 

編號

S

A

4/27

5/21

4/23

5/21

1

0.26

0.30

0.27

0.31

0.28

0.67

0.64

0.69

0.80

0.66

0.64

0.63

2

0.31

0.32

0.30

0.31

0.29

0.71

0.75

0.79

0.85

0.59

0.70

0.68

3

0.36

0.38

0.35

0.37

0.35

0.79

0.80

0.84

0.86

0.72

0.73

0.72

4

0.59

0.61

0.58

0.60

0.61

0.85

0.82

0.94

0.92

0.83

0.81

0.82

5

0.80

0.81

0.82

0.80

0.81

0.91

0.87

0.95

0.93

0.90

0.88

0.88

6

0.95

0.95

0.94

0.96

0.97

0.94

0.89

0.96

0.96

0.93

0.91

0.91

 

編號

B

C-

D

E

F

4/30

4/24

5/15

5/14

5/21

4/24

5/15

5/22

1

0.42

0.44

0.73

0.64

0.72

0.54

0.53

0.66

0.62

0.62

0.63

0.61

0.63

2

0.48

0.47

0.77

0.67

0.76

0.56

0.55

0.70

0.68

0.66

0.67

0.65

0.68

3

0.61

0.63

0.82

0.72

0.80

0.67

0.68

0.75

0.71

0.71

0.72

0.71

0.71

4

0.72

0.72

0.88

0.77

0.84

0.79

0.80

0.83

0.81

0.79

0.78

0.79

0.77

5

0.79

0.78

0.91

0.87

0.88

0.88

0.89

0.88

0.88

0.88

0.87

0.87

0.88

6

0.92

0.90

0.93

0.90

0.90

0.91

0.90

0.90

0.91

0.91

0.92

0.91

0.90

 

【備註】 S:中山女高校內

 A:長安東路、建國北路口

 B:長安東路二段 

 C:中正國小側門

 D:八德路巷內

 E:南京東路、建國北路口

 F:信義路四段

 

(四)、             管柱分離出不同區間的色素顏色如下:

色塊取得順序

色素顏色

 

七、              討論:

(一)、         關於試驗物品:

1、           榕樹老葉及嫩葉中,所含色素無明顯差異;但是枯葉所含的色素和前兩者相比,綠色色素明顯少很多,以黃色為主。

2、                       除了榕樹葉外,我們還以黛粉葉作為試驗對象(深色的外圈和淺色的內圈互相比較),結果發現:看似翠綠的外圈樹葉經展層後與淡綠色樹葉的內圈色樹幾乎相同,內圈色素含量較少,其結果與榕樹的老葉與嫩葉相似。

3、                       我們可以把數據分成較接近的三類:

(1)、  空氣污染低的地點(S:學校。因為校園四周種植了大量的樹木,對於外面車輛廢氣及塵埃影響較小。);

(2)、  塵埃多的路段(B,D。此兩處的葉子取下時,葉面上覆有一層厚厚的塵埃。)

(3)、  交通流量大的路段上(A,C,E)。

而我們發現這些數據中,移動越遠的色塊,Rf值越接近。我們利用Excel將數據繪製成圖表,結果請參見附件一。

4、                       萃取出的色素最好當天使用,因為其中有些色素易氧化,如胡蘿蔔素,會影響實驗結果。

5、                       管柱內填裝好的矽膠粉最好盡快使用,以免變質。

6、                    經由參考資料,我們得到葉綠素中可能含有:

Chlorophyll a 氧化態

Carotem α

Carotem β

Chlorophyll a

Chlorophyll b 的氧化態

Chlorophyll b

Xanthophyll

每個成分都有不同的Rf值,但是由於參考資料提供的是在10份丙酮及90份石油醚的系統中所得的數據,與我們丁酮及乙酸乙酯比例為1:15的系統不同,而每個成分對不同展層液的親和力不同,Rf值也會相異,所以我們還無法確定每個色塊可能的成分。

 

(二)、         有關操作方面:

1、           經過多次的實驗,發現密閉容器的效果比開放系的好很多(例如用有蓋的玻璃瓶)。密閉環境會使展層液的蒸氣均勻分布在容器中,使吸附液面呈水平上升,展層效果達到最佳。

2、           矽膠板會因長期接觸空氣而受潮,矽膠凝體容易發生脫落的現象。應事先將其放入烘箱中除去水分(約5分鐘,90℃),即可改善這種現象。

3、           即使用同一種展層液,分層結果也會因介質不同(如:矽膠板及濾紙)而有不同的結果。但濾紙不是很好的色層分析介質;矽膠凝體的分層較明顯、清楚,效果較佳。

4、           我們曾經使用隔水加熱法粹取葉綠素,但是所需時間長,且最後的葉綠素濃度仍然不夠,需要用研缽再次研磨,才能得到較佳的濃度值。故不宜採用隔水加熱法。

 

 

八、      結論:

1、           我們發現,由乙酸乙酯:丁酮=15:1所配置成的展層液,能達到最佳的展層效果。

2、           由展層後的矽膠板可知:葉齡對於榕樹的綠色色素並無明顯影響。

3、           Rf值可判斷,污染量的差異,主要的影響是對於Rf值較小的色塊,若以學校的結果為標準,則污染越大的地區,編號小的色塊Rf值會越大。但是對於編號大的色塊,卻不會發生較大的影響,所有的數據在色塊5以及6所得的Rf值幾乎是相同的。

 

 

 

九、       未來與展望:

(一)、         由參考資料中,我們得知因為矽膠凝體為弱酸性,若在萃取液中加入一滴酸 ,會對展層效果產生影響,由於時間的因素,我們未完成此實驗,希望往後如果有機會可繼續這個研究,做進一步的實驗。

(二)、         由於色素對於各種展層液的親和度不同,故Rf值會隨之有所不同,我們無法就手邊的參考資料判定所得的六個色塊分別為何種色素(因為文獻所採用的流動相組成及比例皆與我們使用的不同)。因此往後若還會繼續進行研究,我們計劃從矽膠板上將色塊挖下,在利用吸光儀將色素的種類加以確定。

(三)、         我們所採用的流動相-丁酮(CH3COC2H5)及乙酸乙酯(CH3COOC2H5)的結構式相近,故想更進一步的探討:兩種結構式近似的混合流動相,比任意選取之混合流動相的展層效果更佳。

 

乙酸乙酯

丁酮

 

 

 

八、              參考資料及其他:

 

基礎液相色層分析 Basic Liquid Chromatography

高文弘編譯

黎明書店總銷

民國七十一年

植物生理學實驗

王月雲、陳是瑩、童武夫編註

藝軒圖書出版社
發行

民國八十二年

高效液相層析科技
〈難題實解〉

陳孟英博士
編寫

國立編譯館出版

民國八十年

色層分析法概論

 

銀禾文化事業公司

民國七十九年

化學化工百科辭典

 

曉園出版社

民國七十六年

儀器分析

陳陵授、吳慧眼著

三民書局出版

民國八十六年

儀器分析原理
 Principles of Instrumental Analysis

許炎和編譯

國興出版社發行

民國七十四年

作物之光合作用

林安秋編著

台灣商務印書館
發行

民國七十三年

儀器分析

王應瓊編注

中央圖書出版社
出版

民國八十三年

分析化學
Analytical Chemistry

闕山仲等編譯

藝軒圖書出版社
印行

民國八十三年

 

補充資料:

(一)、         葉綠素:

     光合作用必要之綠色色素。除了菌類和蕈類,所有植物皆有葉綠素,有三種形式(a,b,c),此三種皆為以鎂為中心原子的紫質。還有親水性的碳環(帶有親脂性的葉綠尾)。葉綠素可以接收至波長700mμ的光子,將其輻射能轉換至化學環境中,所以在光合作用中,其功能如同轉換器,其結構類似紅血球色素血晶素。葉綠素a目前可經由兩種不同路徑合成。它的衍生物對於光、氧化劑和化學試劑都相當不穩定,沒有毒性。

(節錄自《化學化工百科辭典》,曉園出版社。1987)

 

(二)、         葉綠素靈:

氫氧化納(或鉀)的乙醇溶液和樹葉的乙醇萃取液作用所得的產物。甲基和葉綠醇基(羥基 -OH)被鹼所取代(變為 -ONa),但是鎂沒有被取代。

 

特別感謝:

廖淑芬及林錦瑞老師

吳錦質先生

          國立交通大學浩然圖書館

          中山女高圖書館

         


(附件一)

 

 

 

 

(附件二)實驗進度表

(附件三)相關照片

老葉

嫩葉

枯葉

 

管柱

 

(附件四)專有名詞中英對照:

 

 

色層分析Chromatography

沖提 elution

矽膠 silica gel

流動相 moving(mobile) phase

梯度沖提 gradient elution

載體 support

管柱色層分析 column chromatography

管柱層析法 column chromatography

滯留時間 retention time

誤差 error

精確性 precision

膠體滲透 gel permeation

膠體過濾 gel filtration

薄層色層分析 thin layer chromatography

礬土 alumina

毛細潤濕 capillary wetting

介質 medium

吸附 adsorption

膠凝體;凝膠 gel

靈敏度 sensitivity

流動相 mobile phase

沖提 eluent

分析樣品 Analytical sample

石油醚 petroleum ether

醋酸 Acetic acid